¿Qué es el valor Ct en PCR en tiempo real?

Si has trabajado con PCR en tiempo real (qPCR)Probablemente hayas oído hablar del término valor Ct, y por una buena razón. Es la piedra angular de esta tecnología, ya que te ayuda a interpretar los resultados con precisión.

Ya sea que esté diagnosticando patógenos, estudiando la expresión genética o trabajando en un proyecto de investigación, comprender los valores de Ct puede brindarle la información que necesita para tener éxito. Analicémoslo juntos.

¿Qué es el valor Ct?

El valor Ct (valor de umbral de ciclo) le indica cuántos ciclos de amplificación se necesitan para que el ADN o ARN objetivo genere suficiente fluorescencia para cruzar un umbral establecido.

• Valores bajos de Ct (p. ej., 15-20): Señala una alta concentración del objetivo.
• Valores altos de Ct (p. ej., 35-40): Indica una concentración menor o incluso una ausencia del objetivo.

Piense en ello como un reflejo del material de partida de su muestra. Una concentración objetivo más alta significa que se necesitan menos ciclos para la detección, mientras que una concentración más baja requiere más tiempo.

Los valores de Ct se determinan durante la fase exponencial del proceso de PCR, donde la eficiencia de amplificación es máxima. Esto garantiza la reproducibilidad, ya que la fase exponencial ofrece una amplificación constante que no se ve afectada por la disminución de los reactivos (Yuan et al., 2006).

¿Cómo se pueden determinar los valores Ct?

Cuando se realiza un experimento de PCR cuantitativa, los datos se muestran como un gráfico de amplificación. Este gráfico muestra la fluorescencia (señal) en el eje vertical y los números de ciclo en el eje horizontal. Así es como funciona:

1. Fase de línea base:En los primeros ciclos, la fluorescencia permanece estable. El objetivo puede estar amplificándose, pero la señal es demasiado débil para detectarla.
2. Fase exponencial:A medida que avanza la reacción, la fluorescencia aumenta bruscamente. Es entonces cuando la señal se vuelve detectable y cruza el umbral.
3. Valor Ct:El número de ciclo en el que la curva de amplificación cruza el umbral es el valor Ct. Este es el punto que necesita para una cuantificación precisa.

El umbral se establece en la fase exponencial, donde la amplificación es más confiable. Según Thermo Fisher Scientific (2012), establecer los umbrales correctamente minimiza la variabilidad y garantiza la determinación precisa del valor de Ct en todos los pocillos de un Sistema de PCR en tiempo real.

Cómo se pueden utilizar los valores Ct

Los valores Ct no son solo números, son métricas importantes que lo ayudan a sacar conclusiones significativas de sus datos:

1. Ensayos cualitativos

¿Quiere saber si hay un patógeno presente? Un valor Ct le indica si se detectó el objetivo en su reacción. ¿No hay valor Ct? Eso significa que no se encontró ningún objetivo. La falta de valor Ct significa que no se detectó el objetivo, mientras que su presencia confirma la amplificación (Thermo Fisher Scientific, 2012).

2. Ensayos cuantitativos

¿Necesita mediciones precisas? Los valores de Ct se pueden convertir en cantidades mediante ecuaciones como el método ΔΔCt. Los métodos cuantitativos se utilizan ampliamente para estudios de expresión genética y cuantificación de patógenos. Este método normaliza los valores de Ct utilizando genes de control y calibradores, lo que garantiza la relevancia biológica (Rao et al., 2021).

¿Qué afecta los valores de CT?

Varios factores pueden influir en sus valores de Ct:

1. Eficiencia de la reacción:La eficiencia ideal debería ser del 100 %, donde el objetivo se duplica en cada ciclo (Yuan et al., 2006). Una eficiencia subóptima genera valores de Ct inconsistentes y datos poco confiables.
2. Configuración de umbral:Si se establece un umbral demasiado bajo, se puede captar ruido, mientras que si se establece un umbral demasiado alto, se puede perder la fase exponencial. El equilibrio adecuado garantiza la precisión. Thermo Fisher Scientific (2012) destaca la importancia de establecer umbrales dentro de la fase exponencial para garantizar la determinación precisa del valor Ct.
3. Calidad de placas y cicladores:Las placas de mala calidad o un termociclador no calibrado pueden generar variabilidad. Un mantenimiento regular marca una gran diferencia.

Consejos para obtener resultados confiables

¿Quieres que tus valores de Ct sean siempre correctos? Sigue estos consejos:

• Optimice sus ensayos:Utilice reactivos validados y vuelva a verificar sus diseños de cebadores.
• Mantenga el equipo en óptimas condiciones:Calibre periódicamente su termociclador e inspeccione sus placas de PCR.
• Establecer umbrales claros:Asegúrese de que sus umbrales estén en la fase exponencial de la curva de amplificación para mantener la coherencia.
• Normalice sus datos:Utilice genes de control y calibradores para tener en cuenta las variaciones en la preparación de la muestra o la eficiencia de la reacción.

¿Por qué los valores CT son importantes para usted?

El valor Ct es más que un simple número: es la clave para comprender lo que sucede en las muestras. Ya sea que esté diagnosticando enfermedades o realizando estudios de expresión genética, los valores Ct confiables garantizan que sus datos sean precisos y procesables.

Prestando atención a los detalles y utilizando las herramientas adecuadas como Máquina de PCR en tiempo realPuede confiar en los resultados de la qPCR para orientar sus decisiones, ya sea que esté diagnosticando enfermedades, estudiando genes o desarrollando soluciones innovadoras. Después de todo, la precisión en el laboratorio comienza con usted y el valor Ct es su guía de confianza.

Referencias

• Jarvis, NA, O'Bryan, CA, Dawoud, TM, Crandall, PG y Ricke, SC (2011). Selección de un valor de corte para los resultados de la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real para reducir los resultados falsos positivos en la detección de Salmonella en muestras de carne y canales. Revista de investigación diagnóstica veterinaria, 23(1), 55-61. https://doi.org/10.1177/104063871102300102 
• Rao, SN, Manissero, D., Steele, VR y Pareja, J. (2021). Una revisión sistemática de la utilidad clínica de los valores umbral del ciclo en el contexto de la COVID-19. Diagnóstico, 11(6), 1091. https://doi.org/10.3390/diagnostics11061091 
• Thermo Fisher Scientific. (2012). PCR en tiempo real: comprensión de Ct. [Nota de aplicación]. Recuperado de https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/Application-Notes/cms_053906.pdf
• Yuan, JS, Reed, A., Chen, F. y Stewart, CN (2006). Análisis estadístico de datos de PCR en tiempo real. Bioinformática BMC, 7, 85. https://doi.org/10.1186/1471-2105-7-85